总览：实验 10：生物化学

这个实验由三个独立但相互关联的部分组成，旨在在一个实验课时内完成，介绍了生物化学中的基本技术和概念。本实验的核心在于探索生物大分子——特别是氨基酸、蛋白质和核酸——的化学性质和分离方法。

• A 部分 (实验 10A): 重点是纸色谱法，这是一种基于化合物在固定相（纸）和流动相（溶剂）之间分配差异的分离技术。你将利用这种技术分离并初步鉴定一个包含已知和未知氨基酸的混合物，通过计算 Rf 值（比前沿值）来实现。
• B 部分 (实验 10B): 重点是蛋白质的分离和鉴定。你将利用等电点沉淀法从牛奶中分离出主要蛋白质——酪蛋白。随后，将对分离出的酪蛋白进行一系列定性化学测试（双缩脲试验、茚三酮试验、重金属离子试验、黄蛋白试验），以验证其蛋白质特性并了解其组成特点。
• C 部分 (实验 10C): 重点是核酸的提取。你将学习并实践从植物组织（洋葱）中提取脱氧核糖核酸 (DNA) 的基本步骤，包括细胞裂解、去除蛋白质和脂质，以及最终通过乙醇沉淀法分离出 DNA。

完成这三个部分将使你掌握或了解色谱分离、蛋白质等电点沉淀、蛋白质定性分析以及 DNA 粗提等重要的生物化学实验技术。

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实验 10A：使用纸色谱法鉴定氨基酸 (Amino Acids) 混合物

总览 (A 部分): 本部分的目的是利用纸色谱法分离一个包含四种已知氨基酸（丙氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、赖氨酸）、这些氨基酸的混合物以及一种未知氨基酸的样品。通过比较未知氨基酸的迁移距离（以 Rf 值表示）和颜色与已知氨基酸标准品的对应值，来鉴定未知物。核心原理是利用氨基酸侧链 (R 基团) 极性的不同，导致它们在极性固定相（纸上的水）和相对非极性的流动相（展开溶剂）之间分配不同，从而以不同的速率向上迁移。

详细步骤解释 (A.5 步骤):

注意：务必在整个过程中戴上手套！

• 详细解释： 人的手指皮肤上会分泌油脂和氨基酸（来自蛋白质）。如果直接触摸滤纸，这些物质会转移到纸上，成为污染物。这些额外的氨基酸或油脂会干扰样品的移动，可能产生额外的斑点或导致条带拖尾，从而影响 Rf 值的准确性，导致错误的鉴定结果。戴手套可以防止这种污染。
• 目的： 确保色谱纸的纯净，避免引入干扰物质，保证实验结果的准确性和可靠性。

Step1 滤纸准备 (Paper Preparation)

• 详细解释：
  • 获取 Whatman® No. 2 滤纸： 这是一种特定等级的色谱滤纸，由纯纤维素制成。纤维素具有高度极性，并且能吸附一层薄薄的水分子，这层水构成了纸色谱中的固定相。滤纸的孔隙结构允许流动相通过毛细作用向上移动。
  • 描绘和剪裁矩形 ($10 \mathrm{~cm} \times 11 \mathrm{~cm}$，并裁剪边缘)： 使用铅笔（石墨是惰性的，不会随溶剂移动）和尺子精确绘制尺寸。裁剪掉边缘（每边 0.5 cm）是为了去除可能不均匀或在处理过程中被触摸过的边缘，确保纸张的均匀性，从而使溶剂前沿更整齐地上升。
  • 画基线 (Bottom line上方 2 cm)： 这条线是起始线或原点线。所有样品都将点在这条线上。将其设置在距离纸张底部 2 cm 的位置，是为了确保当纸张底部浸入溶剂时，起始线上的样品点高于溶剂液面。如果样品点浸入溶剂，它们会溶解在溶剂池中而不是随着溶剂前沿向上移动，导致色谱分离失败。
  • 标记点样位置 (六个标记 'x')： 在基线上均匀地标记六个点，用于精确放置不同的样品。均匀分布有助于防止相邻样品的斑点在展开过程中混合或重叠。
  • 编号 (1 到 6)： 对每个标记点进行编号，并对应特定的样品（1: Ala, 2: Asp, 3: Leu, 4: Lys, 5: Mixture, 6: Unknown）。这对于后续识别分离后的斑点至关重要。
• 目的： 制备一块尺寸标准、带有清晰起始线和标记点样位置的色谱纸（固定相），为后续的样品应用和色谱展开奠定基础，并确保样品起始位置高于溶剂液面。

Step2 点样设置 (Setup for Spotting)

• 详细解释：
  • 放置在铝箔上： 铝箔提供一个干净、不吸收的表面，防止工作台上的任何污渍或化学品污染滤纸的背面。
  • 用铅笔/钢笔抬高纸张： 将铅笔或钢笔放在铝箔上，位于基线上方，然后将滤纸搭在上面。这样可以将滤纸的工作区域（特别是基线附近）抬离铝箔表面。这可以防止在点样时，毛细管尖端接触样品溶液后可能意外接触到下面的铝箔，或者防止溶剂扩散到纸张背面。
• 目的： 提供一个干净且略微抬高的平台进行点样操作，防止滤纸在点样过程中受到下方表面的污染。

Step3 样品应用 (Sample Application)

• 详细解释：
  • 使用干净毛细管： 为每种样品（1-6）使用一根单独的、干净的毛细管。这是为了防止样品之间的交叉污染，否则会导致结果混乱，无法准确鉴定未知物。
  • 轻触纸张，避免戳孔： 毛细管尖端只需轻轻接触标记的 'x' 点即可，让溶液通过毛细作用吸收到纸上。用力戳会损坏纸张纤维结构，干扰溶剂的均匀流动和样品的迁移。
  • 少量、多次、干燥后重复： 这是点样的关键技术。每次只点非常少量的样品溶液，然后等待其完全干燥（可以用吹风机冷风档或室温下等待）。干燥后再重复点样数次。这样做的目的是将足够量的样品浓缩在一个尽可能小的点上。
  • 为什么小点很重要： 如果一次点大量样品，溶液会扩散开，形成一个大的起始斑点。在色谱展开过程中，大的起始斑点会导致分离后的谱带（斑点）变宽、弥散，甚至可能相互重叠，使得分离效果变差，Rf 值测量不准确。小而集中的起始点能得到更清晰、更窄、分离更佳的谱带。
• 目的： 将已知和未知的氨基酸样品精确、浓缩地施加到色谱纸的起始线上，同时避免交叉污染和纸张损坏，为获得良好的色谱分离效果打下基础。

Step4 折叠与试装 (Folding and Checking Fit)

• 详细解释：
  • 从中心对折，斑点在外面： 将纸张沿垂直于基线的方向对折，使带有样品点的一面朝外。对折的目的是让纸张能够立在烧杯中，形成一个类似帐篷的结构，而不需要依靠烧杯壁（过度接触烧杯壁会干扰溶剂流动）。斑点朝外可能有助于观察，并确保折痕不会直接穿过样品点。
  • 检查是否适合 600 mL 烧杯： 将折叠好的纸放入空的 600 mL 烧杯中，检查它是否能稳定地立在里面，底部边缘能平稳接触杯底，并且纸张两侧不会紧贴烧杯壁。
  • 加入溶剂前取出： 试装合适后，必须先将纸张取出，再向烧杯中加入溶剂。这是为了防止在调整纸张位置时不小心让样品点接触到溶剂。
• 目的： 将色谱纸塑形以便能在烧杯中稳定站立，并预先确认其尺寸与烧杯匹配，确保色谱展开时纸张位置正确且不受侧壁干扰。

Step5 展开溶剂准备 (Solvent Preparation)

• 详细解释：
  • 倒入 50 mL 展开溶剂： 将预先配制好的展开溶剂（乙酸、1-丁醇和水的混合物）倒入 600 mL 烧杯中。这个溶剂混合物构成了色谱过程中的流动相。其组成（包含极性的水、乙酸和相对非极性的 1-丁醇）决定了它的整体极性，从而影响不同极性氨基酸在其中的溶解度和与固定相的竞争吸附。
  • 放置在通风橱下： 1-丁醇和乙酸都具有挥发性和刺激性气味。在通风橱中操作可以确保实验安全，将有害气体排出实验室。
• 目的： 将流动相（展开溶剂）加入色谱缸（烧杯）=Developing Chamber展开室中，并在安全的环境（通风橱）下进行。

Step6 色谱展开 (Chromatogram Development)

• 详细解释：
  • 小心插入纸张： 将折叠好的色谱纸小心地放入盛有溶剂的烧杯中。确保纸张底部边缘均匀浸入溶剂中，但起始线（带有样品点）必须位于溶剂液面上方约 1 厘米处。这是色谱法成功的关键：溶剂通过毛细作用从底部边缘被吸上纸张，流过样品点，并将样品组分带上去。
  • 用铝箔紧密盖住烧杯口： 用一块铝箔纸将烧杯口封住。目的是在烧杯内部创造一个溶剂蒸气饱和的环境。如果烧杯不密封，流动相在向上移动的过程中会不断从纸上蒸发，导致溶剂前沿移动速度变慢且不均匀，影响 Rf 值的重现性和准确性。饱和环境可减少蒸发，确保溶剂以较**恒定的速率**上升。
• 目的： 启动色谱分离过程，让流动相在饱和的蒸气环境中通过毛细作用沿固定相（纸）向上移动，带动样品组分进行分离。

Step7 控制展开距离 (Solvent Front Movement)

• 详细解释：
  • 溶剂开始向上移动： 溶剂通过毛细作用，克服重力，沿着纸张纤维向上爬升。
  • 让溶剂前沿移动约 8 厘米： 溶剂前沿是流动相向上移动达到的最前端清晰界限。需要让溶剂移动足够的距离（这里建议约 8 厘米，从基线算起），以便不同组分（氨基酸）有足够的时间和空间根据它们与固定相和流动相的相互作用差异而分离。如果距离太短，分离不充分；如果距离太长（例如到达纸顶），则无法计算溶剂前沿距离。这是一个经验性的距离，旨在获得较好的分离效果。
• 目的： 允许色谱分离进行足够长的时间和距离，以达到不同氨基酸组分之间的有效分离。

Step8 标记溶剂前沿并干燥 (Marking Solvent Front and Drying)

• 详细解释：
  • 从烧杯中取出纸张： 当溶剂前沿达到期望高度（约 8 cm）时，小心地将色谱纸从烧杯中取出，终止色谱展开过程。
  • 立即用铅笔标记溶剂前沿： 由于溶剂会很快蒸发，必须在取出纸张后立刻用铅笔轻轻画一条线标记溶剂前沿的准确位置。这条线是计算 Rf 值时所需的分母（溶剂移动的总距离）。
  • 彻底干燥纸张： 在进行下一步显色之前，必须将纸上的流动相溶剂（水、乙酸、丁醇）完全去除。残留的溶剂，特别是酸性或碱性组分，可能会干扰茚三酮显色反应。
  • 使用吹风机辅助干燥： 可以使用吹风机（最好是冷风或温和热风档，避免过热使纸张变脆或降解样品）来加速干燥过程。确保纸张完全干燥，没有溶剂气味。
• 目的： 终止色谱分离，精确记录流动相移动的总距离（溶剂前沿），并彻底去除流动相，为后续的显色步骤做准备。

Step9 显色反应 (Visualization with Ninhydrin)

• 详细解释：
  • 在通风橱中喷洒茚三酮溶液： 氨基酸是无色的，需要通过化学反应使其可见。茚三酮是常用的氨基酸显色剂。将干燥的色谱纸平放在通风橱内（茚三酮试剂有刺激性），用喷雾器均匀地喷洒茚三酮溶液。
  • 颜色出现： 茚三酮与氨基酸的 α-氨基发生反应（脯氨酸除外，它与仲氨基反应），生成一种称为“汝曼紫”（Ruhemann's purple）的蓝紫色化合物。反应通常在室温下需要一些时间（约 15 分钟或更长）才能显现。
  • 用吹风机稍微加热： 温和加热（例如用吹风机暖风档，保持距离，避免过热）可以加速茚三酮与氨基酸的反应，使有色斑点更快、更清晰地出现。注意不要烤焦纸张。
  • 颜色和强度的变化： 不同氨基酸可能因其结构或与茚三酮反应的化学计量略有不同，导致颜色略有差异（例如，脯氨酸通常呈黄色或棕色），斑点强度也可能不同。
• 目的： 通过与茚三酮试剂反应，将纸上分离后不可见的氨基酸斑点转化为可见的有色斑点，以便定位和测量。

Step10 测量距离 (Measurement for Rf Calculation)

• 详细解释：
  • 标记每个斑点的中心： 待颜色稳定后，仔细观察每个有色斑点，并用铅笔轻轻标记出其几何中心。由于斑点可能有一定的大小和形状，取中心点是为了获得一个一致的、有代表性的迁移位置。
  • 测量斑点距离： 使用公制尺子，精确测量从原始基线（步骤 1 中画的线）到每个斑点中心的距离。记录每个斑点（包括标准品 1-4，混合物中的多个斑点，以及未知物 6 的斑点）的距离值，精确到小数点后两位（例如 3.45 cm）。
  • 测量溶剂前沿距离： 同样使用尺子，精确测量从原始基线到步骤 8 中标记的溶剂前沿线的距离。这个值对于所有斑点都是相同的（在同一张色谱图上）。记录该值，精确到小数点后两位（例如 8.10 cm）。
  • 用于计算 Rf 值： 这两个测量值是计算每个氨基酸 Rf 值的依据。Rf = (斑点移动距离) / (溶剂前沿移动距离)。
• 目的： 获取计算 Rf 值所需的定量数据：每个分离组分（氨基酸）从起点移动的距离和流动相（溶剂）从起点移动的总距离。

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实验 10B：酪蛋白的分离和鉴定

总览 (B 部分): 本部分的目的是从常见食品——牛奶中分离其主要蛋白质酪蛋白，并利用一系列经典的化学测试来验证分离产物的蛋白质属性以及某些结构特征。第一部分利用等电点沉淀原理，通过调节牛奶的 pH 值至酪蛋白的等电点 (pI ≈ 4.6)，使其溶解度降至最低而沉淀析出，并通过溶剂洗涤去除脂肪杂质。

第二部分则对分离得到的酪蛋白以及几种参照物（氨基酸、已知蛋白质）进行四种定性蛋白质化学测试：双缩脲试验（检测肽键）、茚三酮试验（检测游离氨基）、重金属离子试验（观察重金属对蛋白质的沉淀作用）和黄蛋白试验（检测含苯环的氨基酸残基）。

详细步骤解释 (B.5 步骤):

B.5.1 第一部分：酪蛋白的分离 (Isolation of Casein)

Step1 水浴准备 (Water Bath Setup)

• 详细解释：
  • 设置水浴： 在一个 600 mL 烧杯中加入约 200 mL 自来水，并放入一个磁力搅拌子。将烧杯放在带有搅拌功能的电热板上。
  • 加热和搅拌设置： 将加热设置为中低档（目标是使水浴温度达到约 40°C），并将搅拌速度设置为低速（2-3 档）。使用水浴加热可以提供比直接加热更温和、更均匀的加热方式，避免牛奶局部过热或烧焦。搅拌水浴有助于整个水浴的温度均匀。
• 目的： 建立一个恒温水浴系统，为后续温和、均匀地加热牛奶样品做准备。

Step2 加热牛奶 (Heating Milk)

• 详细解释：
  • 称取牛奶： 在一个 250 mL 锥形瓶中精确称量约 50 g 牛奶。准确称量起始牛奶质量是计算最终酪蛋白产率（百分比）所必需的。
  • 放置并加热： 将装有牛奶的锥形瓶用夹子固定在水浴中，确保水浴的水位高于锥形瓶内牛奶的液面，以实现有效的热传递。将牛奶加热至大约 40°C。
  • 搅拌和测温： 加热过程中，应使用搅拌棒（或轻轻晃动锥形瓶）频繁搅拌牛奶，以确保其受热均匀。关键是测量并监控牛奶本身的温度，而不是水浴的温度，使用温度计直接插入牛奶中测量。温度计不需要一直夹着，可以间歇性测量。将牛奶加热到 40°C 左右是为了提高后续酸沉淀反应的效率，同时避免过高温度导致其他蛋白质（如乳清蛋白）过度变性。
• 目的： 将牛奶样品温和且均匀地加热至约 40°C，为下一步的等电点沉淀创造适宜的温度条件，并记录起始牛奶质量用于后续计算。

Step3 等电点沉淀 (Isoelectric Precipitation)

• 详细解释：
  • 移出烧瓶并加酸： 将达到 40°C 左右的牛奶从水浴中取出。在持续搅拌（用搅拌棒）的同时，逐滴加入约 10 滴冰醋酸 (浓醋酸)。
  • pH 调节： 牛奶的天然 pH 约为 6.6-6.8。酪蛋白是一种蛋白质，其净电荷随溶液 pH 而变化。冰醋酸是一种弱酸，加入后会降低牛奶的 pH 值。
  • 等电点 (pI)： 酪蛋白的等电点 (pI) 大约在 pH 4.6。在此 pH 值下，酪蛋白分子携带的正电荷和负电荷数量相等，整体净电荷为零。
  • 沉淀形成： 当 pH 接近 pI 时，蛋白质分子间的静电斥力最小，而疏水相互作用和分子间吸引力（正负端吸引）占主导，导致蛋白质分子聚集（aggregate）并从溶液中沉淀出来，形成可见的白色凝乳状固体。这就是酪蛋白沉淀。持续搅拌有助于酸的均匀分散和沉淀的形成。
• 目的： 通过加入醋酸将牛奶的 pH 值调节至酪蛋白的等电点 (pI ≈ 4.6)，利用蛋白质在等电点溶解度最低的原理，使酪蛋白从牛奶溶液中沉淀析出。

Step4 过滤分离酪蛋白 (Filtration of Casein)

• 详细解释：
  • 设置过滤装置： 将一块粗棉布（Cheesecloth）覆盖在一个 250 mL 烧杯的杯口，用橡皮筋将其固定。粗棉布是一种孔径较大的过滤材料，适合快速过滤掉大块的酪蛋白沉淀，同时让液体（乳清）通过。稍微向下按压布的中心形成一个凹陷，便于容纳混合物。
  • 过滤混合物： 将含有酪蛋白沉淀的牛奶混合物倒入粗棉布上进行过滤。液体部分（称为乳清，Whey），含有水、乳糖、可溶性乳清蛋白、矿物质和维生素等，会通过粗棉布流入下面的烧杯中。固体酪蛋白沉淀则被截留在粗棉布上。
  • 挤压去除液体： 松开橡皮筋，将粗棉布包裹住酪蛋白沉淀，轻轻挤压，以去除残留在沉淀物中的大部分乳清液体。
  • 转移沉淀物： 用刮铲（spatula）小心地将粗棉布上的酪蛋白沉淀尽可能刮回到原来的空锥形瓶中，为下一步的洗涤做准备。
• 目的： 将固体酪蛋白沉淀与液体乳清分离，并收集酪蛋白沉淀物以进行后续纯化。

Step5 乙醇洗涤（去脂肪）(Ethanol Wash to Remove Fat)

• 详细解释：
  • 加入 95% 乙醇： 向装有酪蛋白沉淀的锥形瓶中加入 25 mL 的 95% 乙醇。牛奶脂肪（脂质）通常会随着酪蛋白一起沉淀下来。脂肪是酪蛋白样品中的主要杂质之一。
  • 搅拌与溶解脂肪： 乙醇是一种有机溶剂，许多脂质在乙醇中有一定的溶解度，而蛋白质（如酪蛋白）在其中的溶解度较低。搅拌混合物 5 分钟，可以充分接触酪蛋白沉淀和乙醇，使附着的脂肪溶解到乙醇中。
  • 沉淀与倾析： 停止搅拌后，让固体酪蛋白沉淀自然沉降到烧瓶底部。然后，小心地将上层的含有溶解脂肪的乙醇液体倾析（decant）掉，倒入指定的废液容器中。尽量只倒掉液体，保留固体。
• 目的： 利用脂肪在乙醇中的溶解性而酪蛋白不溶的特点，通过乙醇洗涤去除酪蛋白沉淀中夹带的脂肪杂质。

Step6 乙醚:乙醇混合物洗涤 (Ether:Ethanol Mixture Wash)

• 详细解释：
  • 加入 1:1 乙醚:乙醇混合物： 向步骤 5 留下的酪蛋白残留物中加入 25 mL 的 1:1 (体积比) 乙醚:乙醇混合溶剂。
  • 进一步去脂和脱水： 乙醚是一种比乙醇极性更低的有机溶剂，对脂质具有更强的溶解能力。使用乙醚和乙醇的混合物可以更彻底地去除残留的脂肪。同时，这些有机溶剂也有助于去除酪蛋白中残留的水分（脱水作用），有利于后续的干燥。
  • 搅拌： 再次搅拌混合物 5 分钟，以确保溶剂与酪蛋白充分接触，最大限度地溶解残留脂质和去除水分。
  • 安全注意： 乙醚是高度易燃易挥发的液体，此步骤应在通风橱中进行，远离任何明火或电火花源。
• 目的： 使用极性更低的乙醚:乙醇混合溶剂进行第二次洗涤，以更彻底地去除残留的脂质杂质，并初步脱水。

Step7 真空过滤和干燥准备 (Vacuum Filtration and Preparation for Drying)

• 详细解释：
  • 称量滤纸和表面皿： 在进行过滤之前，将一张干净的滤纸放在一个干净、干燥的大表面皿（Watch glass）上，一起精确称重并记录质量。这是“皮重”，用于后续计算干燥酪蛋白的净重。
  • 建立真空过滤系统： 将已称重的滤纸放入布氏漏斗（Büchner funnel）或类似的真空过滤装置中，并连接到真空泵或水力抽气机。用少量洗涤用的溶剂（如乙醇）润湿滤纸，使其与漏斗紧密贴合。
  • 过滤混合物： 将步骤 6 中的酪蛋白与乙醚-乙醇的混合物倒入真空过滤装置中。打开真空，液体溶剂会被快速抽滤掉，固体酪蛋白则留在滤纸上。
  • 冲洗烧瓶： 用少量乙醇冲洗锥形瓶内壁，并将冲洗液也倒入过滤装置中，以确保将所有酪蛋白固体都转移到滤纸上，减少损失。
  • 转移至表面皿干燥： 过滤完成后，小心地将带有酪蛋白沉淀的滤纸从漏斗中取出，放在之前已称重的表面皿上。将表面皿（带滤纸和酪蛋白）放置在通风处（如通风橱内或实验台上）使其完全干燥。干燥过程可能需要一段时间，目的是挥发掉所有残留的乙醇和乙醚。
• 目的： 使用真空过滤高效地收集纯化后的酪蛋白固体，并将其转移到已称重的容器组合上进行彻底干燥，为最终称重做准备。

Step8 称重与计算产率 (Weighing and Yield Calculation)

• 详细解释：
  • 称量干燥酪蛋白： 当滤纸上的酪蛋白完全干燥（通常看起来是白色或淡黄色粉末或小块状，没有溶剂气味）后，将带有滤纸和干燥酪蛋白的表面皿一起进行精确称重，并记录总质量。
  • 计算酪蛋白质量： 干燥酪蛋白的净质量 = (滤纸 + 表面皿 + 干燥酪蛋白的总质量) - (步骤 7 中称得的滤纸 + 表面皿的质量)。
  • 计算牛奶中酪蛋白的百分比（产率）： 酪蛋白百分比 (%) = (干燥酪蛋白的净质量 / 步骤 2 中称得的起始牛奶质量) × 100%。这个值反映了从起始牛奶样品中成功分离并回收的酪蛋白的比例。
• 目的： 确定分离得到的干燥酪蛋白的准确质量，并计算其在原始牛奶样品中所占的质量百分比（产率）。

B.5.2 第二部分：蛋白质的化学分析 (Chemical Analysis of Protein)

Step9 双缩脲试验 (Biuret Test)

• 详细解释：
  • 准备试管和样品： 准备四个干净、标记好的试管。分别加入：
    • a) 15 滴 2% 甘氨酸溶液 (Glycine)：甘氨酸是一种氨基酸，只有一个氨基和一个羧基，没有肽键。作为阴性对照。
    • b) 15 滴 2% 明胶溶液 (Gelatin)：明胶是一种蛋白质（水解胶原蛋白），含有大量的肽键。作为阳性对照。
    • c) 一刮铲尖端大小的分离得到的酪蛋白，并加入 15 滴蒸馏水使其悬浮或溶解。这是待测样品。
    • d) 15 滴 1% 酪氨酸溶液 (Tyrosine)：酪氨酸也是一种氨基酸，没有肽键。作为另一个阴性对照。
  • 加入试剂： 向每个试管中先加入 5 滴 10% NaOH 溶液（提供碱性环境，这是反应所必需的），然后加入 2 滴稀释的 CuSO4 溶液（硫酸铜，提供 Cu²⁺ 离子）。
  • 混合与观察： 充分混合每个试管中的溶液。观察颜色变化。
  • 阳性结果： 如果样品中存在两个或更多肽键（即存在蛋白质或足够长的多肽），Cu²⁺ 离子会在碱性条件下与肽键中的氮原子形成紫红色或紫色的配合物。
  • 阴性结果： 如果样品中没有肽键（如单个氨基酸）或肽键数量不足，溶液将保持硫酸铜本身的蓝色（或者由于 NaOH 可能产生的轻微氢氧化铜沉淀而略显浑浊）。
  • 记录观察结果： 详细记录每个试管的颜色变化。酪蛋白样品如果呈阳性（紫色），则证明其含有肽键，是蛋白质。
• 目的： 利用双缩脲反应检测分离得到的酪蛋白样品中是否存在肽键，从而确认其蛋白质属性。使用阳性（明胶）和阴性（甘氨酸、酪氨酸）对照来验证试验的有效性。

Step2 茚三酮试验 (Ninhydrin Test)

• 详细解释：
  • 准备试管和样品： 准备另外四个干净、标记好的试管，加入与双缩脲试验相同的四种样品：
    • a) 2% 甘氨酸
    • b) 2% 明胶
    • c) 分离的酪蛋白 + 水
    • d) 1% 酪氨酸
  • 加入试剂： 向每个试管中加入 5 滴茚三酮试剂。
  • 混合与加热： 充分混合。然后将所有试管放入沸水浴中加热约 5 分钟。加热是茚三酮反应所必需的。
  • 观察颜色： 观察每个试管中的颜色变化。
  • 阳性结果： 茚三酮与含有游离 α-氨基（-NH₂）的分子（包括所有常见的 α-氨基酸，以及蛋白质或肽链的 N-末端氨基，还有赖氨酸侧链的 ε-氨基）反应，通常生成蓝紫色的化合物（汝曼紫）。（注意：脯氨酸，一种亚氨基酸，会产生黄色）。
  • 预期结果：
    • 甘氨酸（氨基酸）：阳性（紫色）
    • 明胶（蛋白质）：阳性（紫色，来自 N-末端和赖氨酸侧链）
    • 酪蛋白（蛋白质）：阳性（紫色，来自 N-末端和赖氨酸侧链）
    • 酪氨酸（氨基酸）：阳性（紫色）
  • 碱处理（可选）： 如果加热后颜色不明显，说明中提到可以加入 5 滴 10% NaOH 并重新加热。这可能是为了调节 pH 至反应最佳范围（通常是弱酸性至中性，但过酸可能抑制反应）。然而，加入强碱也可能破坏产物或引起副反应，需谨慎操作。
  • 记录观察结果： 记录每个试管的颜色。酪蛋白样品呈阳性（紫色）表明其含有游离氨基，符合蛋白质或其降解产物（如果发生水解）的特征。
• 目的： 利用茚三酮反应检测分离得到的酪蛋白样品中是否存在游离的 α-氨基或赖氨酸侧链氨基，这是氨基酸和蛋白质的共同特征。

Step3 重金属离子试验 (Heavy Metal Ion Test)

• 详细解释：
  • 准备试管和样品： 将少量原始牛奶（注意：这里用的是牛奶，不是分离的酪蛋白）分别装入两个干净、标记的试管中。牛奶富含蛋白质（酪蛋白、乳清蛋白等）。
  • 加入金属盐溶液：
    • a) 向 1 号试管中滴加几滴 Pb(NO₃)₂（硝酸铅）溶液，提供 Pb²⁺ 离子（一种重金属离子）。
    • b) 向 2 号试管中滴加几滴 NaNO₃（硝酸钠）溶液，提供 Na⁺ 离子（一种轻金属离子，非重金属）。作为对照。
  • 观察现象： 观察两个试管中是否出现沉淀或浑浊。
  • 预期结果：
    • 重金属离子 (Pb²⁺)： 重金属阳离子（如 Pb²⁺, Hg²⁺, Ag⁺ 等）可以与蛋白质分子上的负电荷基团（如羧基侧链 -COO⁻）或含有孤对电子的基团（如咪唑环、硫醇基 -SH）发生强烈的相互作用，导致蛋白质变性（结构破坏）并沉淀。因此，加入 Pb(NO₃)₂ 的试管预计会看到明显的白色沉淀或浑浊。
    • 轻金属离子 (Na⁺)： 轻金属离子（如 Na⁺, K⁺）通常不具有这种强烈的变性作用，低浓度下甚至可能增加蛋白质溶解度（盐溶）。因此，加入 NaNO₃ 的试管预计不会出现明显的沉淀。
  • 记录观察结果： 记录两个试管中的现象差异。
• 目的： 演示重金属离子对蛋白质具有强烈的变性沉淀作用，而普通轻金属离子则没有这种效应，以此说明蛋白质对重金属离子的敏感性（这也是重金属有毒性的原因之一）。

Step4 黄蛋白试验 (Xanthoproteic Test)

• 详细解释：
  • 准备试管和样品（通风橱中进行）： 在通风橱中准备四个干净、标记的试管，再次加入与双缩脲试验相同的四种样品：
    • a) 2% 甘氨酸
    • b) 2% 明胶
    • c) 分离的酪蛋白 + 水
    • d) 1% 酪氨酸
  • 加入浓硝酸： 向每个试管中小心地加入 10 滴浓 HNO₃（浓硝酸）。浓硝酸具有强氧化性和腐蚀性，必须在通风橱中操作，并避免接触皮肤。
  • 混合与加热： 充分混合。然后小心地将试管放入温水浴（不需要沸水，约 40-60°C 即可）中加热。
  • 观察颜色变化： 观察是否有黄色出现。
  • 化学原理： 浓硝酸能与蛋白质中含有苯环的氨基酸残基（主要是酪氨酸 Tyr 和色氨酸 Trp，苯丙氨酸 Phe 反应较难）发生硝化反应，在苯环上引入硝基 (-NO₂)，生成黄色的硝基化合物。
  • 预期结果：
    • 甘氨酸（无苯环）：阴性（无黄色）
    • 明胶（含 Tyr 和 Phe）：阳性（黄色）
    • 酪蛋白（含 Tyr, Trp, Phe）：阳性（黄色）
    • 酪氨酸（含苯环）：阳性（黄色）
  • 碱化（可选，但理论提及）： 如果在冷却后向黄色溶液中加入碱（如 NaOH 或氨水），黄色的硝基酚类化合物会电离，颜色会加深变为橙色或橙红色。
  • 记录观察结果： 记录每个试管的颜色变化。酪蛋白样品呈阳性（黄色）表明其含有酪氨酸或色氨酸等带苯环的氨基酸残基。
• 目的： 利用黄蛋白反应检测分离得到的酪蛋白样品中是否存在含有苯环（芳香环）的氨基酸残基（如酪氨酸、色氨酸），从而了解其氨基酸组成特点。

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实验 10C：从洋葱中提取 DNA

总览 (C 部分): 本部分的目的是从植物组织（洋葱）中分离提取脱氧核糖核酸 (DNA)。实验过程主要包括三个关键阶段：1) 细胞裂解：通过物理（切割、搅拌）和化学（加热、去污剂）方法破碎细胞壁和细胞膜，释放细胞内容物；2) 去除杂质：利用去污剂（SDS）使蛋白质和脂质变性沉淀，并通过过滤将其与可溶的 DNA 分离；3) DNA 沉淀：利用 DNA 在冷乙醇中不溶的特性，将 DNA 从裂解液中沉淀出来，并通过缠绕（spooling）的方式收集。本实验旨在让学生直观地观察和获得 DNA 样品，了解 DNA 提取的基本原理和操作。选择洋葱是因为其 DNA 含量相对较高，且淀粉含量较低，不易干扰 DNA 的观察和收集。

详细步骤解释 (C.6 步骤):

注意：务必在整个过程中佩戴手套！

• 详细解释： 人体皮肤表面、唾液等处存在 DNase（脱氧核糖核酸酶），这是一种能够快速降解 DNA 分子的酶。戴手套是为了防止手上的 DNase 污染洋葱样品、试剂或器皿，从而避免提取过程中洋葱 DNA 被降解成小片段。降解后的 DNA 片段太短，将难以在最后步骤中形成可见的絮状物并被缠绕收集。丁腈手套是常用的选择。
• 目的： 保护洋葱 DNA 免受外源性 DNase 的降解，确保能提取到尽可能完整的大分子 DNA。

Step1 洋葱切割 (Onion Chopping)

• 详细解释：
  • 戴手套： 如上所述，防止 DNase 污染。
  • 切割洋葱： 将一个中等大小的新鲜白色洋葱（或其他类型洋葱也可以，但白色洋葱通常色素干扰较少）用干净的刀在干净的砧板上切成小立方体，尺寸不大于 5 毫米。
  • 目的： 切割的目的是物理性地破坏部分细胞结构，并极大地增加洋葱组织的总表面积。这使得后续的化学裂解液（匀浆介质）能够更快速、更有效地渗透到组织内部，接触到更多的细胞，从而提高细胞裂解的效率。
• 目的： 通过机械方式初步破碎洋葱组织，增大表面积，为后续的化学裂解和匀浆处理做准备。

Step2 称重与转移 (Weighing and Transfer)

• 详细解释：
  • 称取 25 g 切碎洋葱： 使用天平精确称量 25 克切好的洋葱丁。确定起始材料的量有助于实验流程的标准化，尽管本实验最终不要求计算产率。
  • 转移到 600 mL 烧杯： 将称好的洋葱丁全部转移到一个干净的 600 mL 烧杯中。选择 600 mL 的烧杯是为了有足够的空间容纳洋葱、后续加入的匀浆介质以及在水浴中加热。
• 目的： 量取定量的洋葱样品，并将其置于合适的容器中，准备进行下一步的化学处理。

Step3 匀浆介质处理与加热 (Homogenization Medium Treatment and Heating)

• 详细解释：
  • 加入 50 mL 匀浆介质： 向装有洋葱丁的烧杯中加入 50 mL 预先配制好的匀浆介质（Homogenization Medium）。该介质包含多种关键成分：
    • SDS (十二烷基硫酸钠): 是一种强力的阴离子去污剂（洗涤剂）。它的主要作用是溶解细胞膜和核膜中的脂质和蛋白质，从而破坏这些膜结构，释放出细胞内容物（包括细胞核和其中的 DNA）。
    • NaCl (氯化钠): 提供 Na⁺ 离子。DNA 的磷酸骨架带有负电荷，Na⁺ 离子可以中和这些负电荷，减少 DNA 分子之间的静电斥力，使其在后续加入乙醇时更容易聚集和沉淀。同时，高盐浓度也有助于解离与 DNA 结合的蛋白质（如组蛋白）。
    • 柠檬酸钠 (Sodium Citrate) 和 EDTA (乙二胺四乙酸): 两者都是螯合剂，能够强力结合二价金属阳离子，特别是 Mg²⁺。Mg²⁺ 是许多 DNase 酶（降解 DNA 的酶）活性所必需的辅因子。通过螯合（“抓住”）Mg²⁺ 离子，柠檬酸钠和 EDTA 可以有效抑制细胞内源性 DNase 的活性，保护 DNA 不被降解。
  • 在 60°C 水浴中孵育 15 分钟（不要超过！）： 将烧杯放入预热至 60°C 的水浴中，保温 15 分钟。这个热处理有几个重要作用：
    • 软化组织： 加热有助于进一步软化坚韧的植物细胞壁，使匀浆介质更容易渗透。
    • 辅助裂解： 热量可以增强 SDS 破坏细胞膜和核膜的效果。
    • 酶变性： 60°C 的温度足以使许多蛋白质（包括大部分 DNase 和其他可能干扰实验的酶）发生热变性而失活，这是保护 DNA 的另一重重要措施。
    • 时间控制： 强调不要超过 15 分钟是因为过长时间的加热也可能开始导致 DNA 本身发生热降解（断裂）。这是一个需要在有效裂解/灭活酶与保护 DNA 完整性之间取得平衡的步骤。
• 目的： 利用化学（匀浆介质中的 SDS、盐、螯合剂）和物理（加热）手段，裂解细胞壁和细胞膜，释放 DNA，同时抑制或灭活内源性 DNase，保护 DNA 分子不被降解。

Step4 快速冷却 (Rapid Cooling)

• 详细解释：
  • 放入冰浴： 将刚从 60°C 水浴中取出的烧杯立即放入一个盛有冰水混合物的冰浴中（例如，在 1000 mL 大烧杯中装入冰块和少量水）。
  • 快速降温至 15-20°C： 目标是尽快将混合物的温度降低到 15-20°C。说明书中建议此过程在约 6 分钟内完成。
  • 目的： 快速降温是为了立即停止 60°C 加热可能带来的任何对 DNA 的潜在损伤（如热降解），并进一步抑制任何可能在较低温度下仍有微弱活性的 DNase。低温环境有利于保持 DNA 的稳定性。
• 目的： 迅速降低样品温度，终止热处理过程，最大限度地保护 DNA 分子免受热降解和酶降解。

Step5 匀浆（搅拌机处理）(Homogenization in Blender)

• 详细解释：
  • 倒入搅拌机： 将冷却后的洋葱和匀浆介质混合物倒入搅拌机（Blender）的容器中。确保盖子盖紧。
  • 低速后高速搅拌： 先用低速搅拌 45 秒，然后再切换到高速搅拌 30 秒。
  • 机械破碎： 搅拌机提供强大的机械剪切力，能够彻底破碎在前面步骤中可能仍保持完整的细胞（特别是坚韧的植物细胞壁）和细胞核，确保将细胞内的 DNA 完全释放到溶液中。
  • 速度控制： 先低速后高速的策略可能是为了先将较大的块打散，再进行更精细的匀浆。需要注意的是，过度搅拌（特别是长时间高速）也可能产生过大的剪切力，将长链的 DNA 分子机械打断成较小的片段，这会影响后续缠绕收集的效果。因此，需要遵循推荐的时间。
• 目的： 利用机械搅拌的强大剪切力，彻底破碎细胞结构，将 DNA 从细胞核中完全释放到裂解液中。

Step6 冰上静置 (Incubation on Ice)

• 详细解释：
  • 倒入烧杯： 将搅拌后的匀浆（homogenate）倒回一个 600 mL 的烧杯中。如果产生了很多泡沫，可以尽量将泡沫留在搅拌杯内，因为泡沫中可能包裹着不希望得到的杂质（如变性蛋白）。
  • 在冰浴中静置 15-20 分钟： 将装有匀浆的烧杯再次放入冰浴中，静置 15-20 分钟。
  • 目的： 在低温下静置有几个目的：
    • 保持低温： 继续保护 DNA 免受酶降解。
    • 促进沉淀： 让 SDS 与变性的蛋白质和脂质形成的复合物以及其他不溶性的细胞碎片有时间充分聚集和沉淀，为下一步过滤分离做准备。
• 目的： 在低温条件下让不溶性杂质（如细胞碎片、变性蛋白质-SDS 复合物）充分沉淀，同时继续保护 DNA 的稳定性，为过滤步骤做准备。

Step7 过滤去除杂质 (Filtration to Remove Debris)

• 详细解释：
  • 通过粗棉布过滤： 将冰上静置后的匀浆小心地通过一层（或几层，取决于需要的过滤精度）粗棉布过滤，将滤液收集到一个干净的 250 mL 烧杯中。同样注意尽量将泡沫和明显的固体块留在原来的烧杯中，不要倒入过滤器。
  • 分离原理： 粗棉布的孔隙足以让溶解在匀浆介质中的 DNA 分子以及其他小分子物质（盐、水、剩余的 SDS 等）通过，形成滤液（filtrate）。而较大的不溶性杂质，如细胞壁碎片、细胞器残骸、以及 SDS-蛋白质/脂质复合物形成的沉淀，则会被粗棉布截留下来。
• 目的： 通过过滤物理性地分离出大部分不溶性的细胞碎片和变性蛋白质/脂质杂质，得到含有相对纯净 DNA 的滤液。

DNA 的沉淀 (Precipitation of DNA):

Step8 冷却滤液 (Cooling the Filtrate)

• 详细解释：
  • 将滤液烧杯放入冰浴： 将收集到 DNA 滤液的 250 mL 烧杯放入冰浴中。
  • 冷却至 10-15℃： 等待滤液的温度降低到 10-15℃。确保滤液本身是冷的，这对于下一步乙醇沉淀的效果至关重要。
• 目的： 确保含有 DNA 的滤液在加入乙醇之前处于足够低的温度，以最大化 DNA 在乙醇中的不溶性，从而提高沉淀效率。

Step9 乙醇沉淀 DNA (Ethanol Precipitation of DNA)

• 详细解释：
  • 量取冰冷的乙醇： 使用一个预先在冰上冷却的 100 mL 量筒，量取 80 mL 冰冷的 95% 乙醇。乙醇必须是冰冷的（通常保存在 -20°C 冰箱或冰桶中），因为 DNA 在冷乙醇中的溶解度远低于室温乙醇。
  • 缓慢加入乙醇： 将冰冷的乙醇非常缓慢地、沿着烧杯内壁倒入含有 DNA 滤液的烧杯中。关键是不要直接倒入溶液中心或快速倒入，而是让乙醇在滤液上方形成一个清晰的分层。乙醇的密度比水溶液低，会浮在上面。
  • DNA 沉淀析出： DNA 不溶于乙醇（特别是在有盐离子存在时，Na⁺ 中和了其负电荷）。当滤液中的 DNA 分子扩散到上层的乙醇层或者在两层界面处遇到高浓度的乙醇时，它们会迅速失去水合层而聚集在一起，从溶液中沉淀析出，形成可见的白色、絮状或粘稠丝状物质。这就是 DNA。
  • 用量调整： 观察沉淀的形成。通常不需要加满 80 mL 乙醇，当看到明显的白色沉淀物出现时，就可以停止加入了。加入过多的乙醇也不会有坏处，但可能稀释样品。
• 目的： 利用 DNA 在冰冷乙醇中不溶，而在含盐水溶液中可溶的性质，通过小心加入冰冷乙醇，使 DNA 从滤液中选择性地沉淀出来。

Step10 缠绕收集 DNA (Spooling the DNA)

• 详细解释：
  • 准备玻棒/木棍： 可以使用一根干净的玻璃搅拌棒或木制细棍（如竹签）。用砂纸轻微打磨棒的末端（如“重要信息”中所述）可以增加其表面粗糙度，有助于 DNA 的起始粘附。注意不要用手触摸打磨过的末端。
  • 缠绕操作： 将棒的末端轻轻插入到乙醇和滤液的界面处，即 DNA 沉淀物形成的地方。然后，仅沿一个方向（顺时针或逆时针）持续、缓慢地旋转棒。同时，可以在烧杯中以大的圆圈缓慢移动棒，以接触和收集更多的 DNA 沉淀物。
  • DNA 聚集： 如果提取的 DNA 分子量足够大且未被过度降解，长链的 DNA 分子会相互缠绕并粘附在旋转的棒上，形成一团可见的、有弹性的粘稠物。
  • DNA 形态： 如果 DNA 降解严重（分子变短），可能无法有效缠绕，而是形成松散的絮状物沉在底部或悬浮在溶液中。
• 目的： 将沉淀出来的长链 DNA 分子通过物理缠绕的方式聚集并从溶液中收集起来，得到一团相对集中的 DNA 样品。

Step11 保存 DNA (Storing the DNA)

• 详细解释：
  • 转移到小瓶： 如果需要保存提取的 DNA 样品，可以将缠绕在棒上的 DNA 团小心地从棒的末端滑入一个装有少量乙醇（通常是 70% 或 95% 乙醇）的小瓶或离心管中。
  • 乙醇的作用： DNA 在乙醇中保持沉淀状态，不易溶解和降解。乙醇还能抑制残留酶的活性，并有脱水作用，有助于长期保存。
  • 盖紧盖子： 确保小瓶的盖子足够紧，以防止乙醇挥发。
• 目的： 将收集到的 DNA 样品转移到含有乙醇的容器中进行储存，以保持其沉淀状态并防止降解，便于后续观察或（在更高级的实验中）进一步分析。

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